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總膽固醇（TC）含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

規(guī)格：100T/96S 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

微量法

總膽固醇（Total Cholesterol，TC）是指所有脂蛋白所含膽固醇的總和，包括游離膽固醇和膽固醇酯。

利用酯酶催化膽固醇酯水解生成游離膽固醇（FC）和游離脂肪酸（FFA），從而把膽固醇酯轉(zhuǎn)化為 FC；進(jìn)一步利用膽固醇氧化酶催化 FC 氧化，生成△4-膽甾烯酮和 H2O2；最后利用過(guò)氧化物酶催化H2O2 氧化 4-氨基安替比林和酚，生成紅色醌類(lèi)化合物，其在 500nm 有特征吸收峰，其顏色深淺與TC 含量成正比。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、天平、低溫臺(tái)式離心機(jī)、微量玻璃比色皿/96 孔板、可調(diào)式移液槍、

EP 管、蒸餾水、異丙醇。產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：異丙醇 100mL×1 瓶，自備，4℃保存；

工作液：液體 30mL×1 瓶，4℃保存；

標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1支，10mg膽固醇，4℃保存。臨用前加入517μL提取液，振蕩溶解，即為50μmol/mL 的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。

操作步驟：

一、樣本處理：

1.組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL

提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。10000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測(cè)。

2.細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 2 秒，間隔 3 秒，總時(shí)間 3min）；然后 10000g，4℃離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.血清（漿）樣品：直接測(cè)定。二、測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 500nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將 50μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)液用提取液稀釋為 2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3、 操作表：(在離心管或 96 孔板中依次加入下列試劑)

第 1 頁(yè) 共 2 頁(yè)

測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管

樣品（µL）20--

標(biāo)準(zhǔn)溶液（μL）-20-

提取液（μL）--20

工作液（µL）180180180

充分混勻，37℃靜置 15min，反應(yīng)完成后測(cè)定 500nm 處吸光值 A，分別記為 A 測(cè)定管、A 標(biāo)準(zhǔn)管和 A 空白管，△A=A 測(cè)定管-A 空白管，△A 標(biāo)準(zhǔn)=A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管， 空白管只需測(cè)一次。

總膽固醇含量計(jì)算

一、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：

以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為 x 軸，其對(duì)應(yīng)的△A 標(biāo)準(zhǔn)為 y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到標(biāo)準(zhǔn)方程 y=kx+b， 將△A 帶入方程得到 x（μmol/mL）

二、總膽固醇含量的計(jì)算：

1.血清（漿）中 FC 含量計(jì)算：

TC 含量（μmol/dL）=x×100。

2.組織中 FC 含量計(jì)算：

1.按樣本蛋白濃度計(jì)算

TC 含量（μmol/mg prot）=x×V 提取÷（Cpr×V 提取）=x÷Cpr。

2.按樣本鮮重計(jì)算

TC 含量（μmol/g 鮮重）=x×V 提取÷W= x÷W

3.細(xì)胞、細(xì)菌中 TC 含量計(jì)算：

TC 含量(μmol/104 cell)=x×V 提取÷500=0.002x。

100：1dL=100mL；V 提取：加入樣本的提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；500:500 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞數(shù)量。

注意事項(xiàng)

當(dāng)△A 大于 1.5 時(shí)，建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

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