植物葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素含量試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

植物葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素廣泛存在于綠色植物組織中，其含量與光合作用、營(yíng)養(yǎng)狀況密切相關(guān)，是反應(yīng)植物生長(zhǎng)狀況的重要指標(biāo)。

測(cè)定原理

根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見(jiàn)光譜的吸收，在某一特定波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯—比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C 和液層厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)可通過(guò)測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)， 則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下吸光度的總和。這就是吸光度的加和性。測(cè)定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類(lèi)胡蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取液在三個(gè)特定波長(zhǎng)下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b及類(lèi)胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測(cè)定葉綠素a、b時(shí)為了排除類(lèi)胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長(zhǎng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、研缽、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、10mL玻璃試管，錫箔紙。

試劑組成和配制

提取液：液體 1000mL，4℃保存。（自備，無(wú)水乙醇：丙酮=1:2） 試劑一：石英砂×1 瓶，4℃保存。

測(cè)定操作

1. 稱(chēng)取約新鮮植物葉片或其它綠色組織，去掉中脈，稱(chēng)取約 0.1g，剪碎，用蒸餾水洗干凈。

2. 加入1mL蒸餾水，少量試劑一（約 50mg），在黑暗或弱光條件下充分研磨，轉(zhuǎn)入10mL玻璃試管。

3. 用提取液沖洗研缽，將所有沖洗液轉(zhuǎn)入玻璃試管，用提取液補(bǔ)充至10mL，玻璃試管置于黑暗條件下或者包上錫箔紙浸提3h，觀(guān)察試管底部組織殘?jiān)?變白則提取*，若組織殘渣未*變白，繼續(xù)浸提至其*變白。

4. 取浸提液200μL于微量石英比色皿/96孔板，提取液調(diào)零，測(cè)定663nm、645nm和470nm處吸光值，分別記為A663、A645 和A470。

計(jì)算公式

微量石英比色皿計(jì)算方法：

葉綠素a含量（mg/g）=（12.7× A663-2.69×A645）×V 提×D÷m÷1000

= 0.01×（12.7×A663-2.69×A645）×D÷m

葉綠素b含量（mg/g）=（22.9×A645-4.68×A663）×V 提×D÷m÷1000

= 0.01×（22.9×A645-4.68×A663）×D÷m

葉綠素總含量（mg/g）=（20.21×A645+8.02×A663）×V 提×D÷m÷1000

= 0.01×（20.21×A645+8.02×A663）×D÷m

類(lèi)胡蘿卜素濃度（mg/g）=【（1000A470-3.27Ca-104Cb）÷229】×V 提×D÷m÷1000

=0.01×【（1000A470-3.27Ca-104Cb）÷229】×D÷m

96孔板計(jì)算方法：

葉綠素a含量（mg/g）=2×（12.7× A663-2.69×A645）×V 提×D÷m÷1000

= 0.02×（12.7×A663-2.69×A645）×D÷m

葉綠素b含量（mg/g）=2×（22.9×A645-4.68×A663）×V 提×D÷m÷1000

= 0.02×（22.9×A645-4.68×A663）×D÷m

葉綠素總含量（mg/g）=2×（20.21×A645+8.02×A663）×V 提×D÷m÷1000

= 0.02×（20.21×A645+8.02×A663）×D÷m

類(lèi)胡蘿卜素濃度（mg/g）=2×【（1000A470-3.27Ca-104Cb）÷229】×V 提×D÷m÷1000

=0.02×【（1000A470-3.27Ca-104Cb）÷229】×D÷m

V 提：提取液體積，10mL；D：稀釋倍數(shù)；m：樣本質(zhì)量，g

注意事項(xiàng)

1. 色素對(duì)光敏感，研磨和提取等操作盡量避光或者在弱光下進(jìn)行。

2. 一定要浸提至組織殘?jiān)?變白，否則提取不充分。

3. 用提取液沖洗研缽一定要沖洗至所有的綠色物質(zhì)被轉(zhuǎn)移至玻璃試管。

4. 測(cè)定時(shí)吸光值超過(guò) 1，可進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

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